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Una carta d’identità per il rene: i 53 geni coinvolti nello sviluppo della CKD.

Epidemiologia genetica e insufficienza renale cronica. Uno studio internazionale coordinato dall’EURAC di Bolzano ha identificato 53 geni associati alla funzione del rene.

Lo sviluppo e il perfezionamento di programmi di cura della malattie croniche, così come per la quasi totalità delle patologie umane, è un percorso che, nella ricerca biomedica, è volto alla determinazione di una matrice genetica, la cui espressione nei pathway molecolari costituisce la chiave di volta per la comprensione dei meccanismi di insorgenza.

“ASSOCIAZIONI A LIVELLO DI 53 LOCI EVIDENZIANO DEI TIPI DI CELLULE E PATHWAY BIOLOGICI RILEVANTI PER LA FUNZIONE DEL RENE.”

È il titolo (tradotto) di una recente pubblicazione apparsa sulla prestigiosa rivista scientifica Nature Communications. Uno studio di epidemiologia genetica i cui risultati hanno aperto nuovi scenari nella scoperta e nella comprensione dei pathway biologici connessi alla funzione renale. “Una carta d’identità del rene”, ha dichiarato Cristian Pattaro, ricercatore del centro di Biostatistica dell’Accademia Europea di Bolzano (EURAC), equipe a capo del CKDGen (Genetica della Malattia Renale Cronica), consorzio internazionale, di cui fanno parte università del calibro della Harvard University e Johns Hopkins University of Baltimore, che ha condotto questa ricerca iniziata nel 2009.

Sono stati identificati e mappati 53 loci genici connessi alla funzionalità e allo sviluppo renale. Una vera svolta al fine del debellamento di una condizione patologica come l’Insufficienza Renale Cronica (CKD, Chronic kidney Diseas) che, come sottolineato dall’EURAC, solo in Italia, colpisce circa 3.5 milioni di persone.

L’Insufficienza Renale Cronica è la diretta conseguenza della Malattia Renale Cronica, causata da una progressiva riduzione di nefroni (unità funzionale fondamentale del rene) funzionanti. Si manifesta, pertanto, mediante una riduzione della funzione di filtrazione. Ciò determina una ridotta abilità da parte del rene di svolgere le sue attività fisiologiche, quale l’eliminazione dei cataboliti del metabolismo azotato e delle sostanze tossiche, poi espulsi con l’urina, e di regolare il contenuto elettrolitico e il pH dei fluidi corporei.

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Fino ad oggi, la causa considerata maggiormente rilevante per l’instaurarsi della condizione patologica è il diabete mellito, seguito dall’ipertensione arteriosa. Entrambe provocano dei danni ai capillari dei reni, limitando la loro efficienza nel processo di filtrazione del plasma sanguigno. L’alimentazione può essere un fattore significativo per contrastare la progressione della malattia. Essa deve essere basata su una dieta povera di sale (per cercare di equilibrare il bilancio di elettroliti) e di proteine (composti azotati), che devono essere sostituite con carboidrati e grassi. Negli individui in cui la funzionalità renale è praticamente compromessa si deve ricorrere alla dialisi o al trapianto.

Uno studio epidemiologico per la CDK.

Il consorzio CKDGen, da circa sei anni, effettua studi di associazione genome-wide (GWAS) per trovare una correlazione genetica con la patologia. L’ipotesi alla base di questo tipo di studi è che diversi polimorfismi genetici le varie “forme” di una sequenza genetica che possono dare luogo a piccole differenze funzionali, possano influire sull’aumento o sulla diminuzione del rischio di sviluppare le cosiddette patologie multifattoriali. La genesi di queste malattie è determinata da fattori ambientali e da fattori genetici. Una componente genetica che si configura come continua e non discreta è l’espressione di un determinato fenotipo, come la funzione renale. Essa è dettata dall’interazione di più geni. Mettendo a confronto il DNA di due gruppi di individui, affetti da CKD e non affetti, il consorzio di ricerca ha osservato delle variazioni genetiche che sono significativamente più frequenti negli individui affetti: tali loci sono appunto “associati” alla CKD, nel senso che a livello di essi è molto probabile localizzare le mutazioni che causano la malattia. Ci si attende che variazioni genetiche frequenti, ma modeste, sia in termini di deviazione dalla sequenza genetica standard sia in termini di effetti sul fenotipo, abbiano un impatto maggiore nello sviluppo della patologia rispetto a mutazioni rare, ma con un effetto più rilevante. È per questo motivo che negli GWAS l’attenzione viene posta sui single-nucleotide polymorphisms, (SNPs). In pratica, quei polimorfismi genetici caratterizzati dalla variazione di un singolo nucleotide.

I risultati di queste ricerche ad ampio spettro hanno portato, dunque, a determinare i due “estremi” dell’intervallo di associazione. È stata osservata una correlazione tra l’espressione di un determinato set di geni e fenotipo della CKD, ma non si era riusciti ancora a comprendere se ci fosse un’associazione diretta tra determinanti genetici e funzionalità del rene. È proprio su questi binari che si assesta quest’ultima pubblicazione del CKDGen: una meta-analisi condotta su 48 studi di associazione genome-wide sull’Insufficienza Renale Cronica.

Una combinazione, attraverso avanzati metodi statistici, di dati provenienti da più studi al fine di ricavarne una conclusione unitaria.

Il consorzio di ricerca ha esaminato dati di associazione riguardo 133313 individui di origine Europea, per ognuno dei quali si sono analizzati circa 2,5 milioni di SNPs (mutazioni di singoli nucleotidi).

L’elemento chiave, trapelato da questa meta-analisi, è l’associazione di 53 geni – 29 geni identificati a cui si aggiungono 24 derivati proprio da quest’ultimo studio– con il tasso di filtrazione glomerulare (eGFR), espressione dell’efficienza dei reni a svolgere la funzione di filtrazione del sangue. L’eGFR è stato calcolato mediante la clearance della creatinina su campioni di urine e indica gli ml filtrati di sangue al minuto per superficie corporea. Un danno al rene comincia ad essere evidente sotto valori 60 ml/min/1,73m2 e si manifesta come CKD sotto valori di 15. La creatinina è un prodotto della reazione di degradazione della fosfocreatina (riserva di gruppi fosfato indispensabile nel metabolismo energetico dei muscoli) e deve essere eliminata, appunto, con l’urina. Al diminuire della eGFR della creatina corrisponde un innalzamento dei livelli ematici di questa molecola, evidente sintomo di una disfunzione al livello del rene.

Diabete mellito: è davvero la prima causa di CDK?

La stratificazione in sottogruppi degli individui considerati è una condizione basilare di una meta-analisi. Il team di ricerca, pertanto, ha preso in considerazione individui diabetici e non diabetici. Dal momento che il diabete mellito è considerato la prima causa di insufficienza renale, gli scienziati del consorzio sono partiti dal presupposto che avrebbero potuto riscontrare, nei due sottogruppi, delle differenze definite nell’espressione dei 53 geni associati all’attività di filtrazione, differenze dovute all’impatto di questo fattore di rischio nella fisiologia del rene.

Invece (come mostrato dal grafico) le differenze fenotipiche, misurate in termini di quantità di creatinina nell’urina, sono minime. Come devono essere interpretate queste rilevazioni? Sicuramente in una nuova chiave di lettura: il diabete mellito non deve essere considerato come uno stadio di progressione della condizione patologica precedente alla CKD. Va certamente ad influenzare l’attività filtratoria del rene, ma non deve, tuttavia, essere valutato come causa dell’Insufficienza Renale Cronica, bensì come una disfunzione indipendente.

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Il rene è un organo altamente vascolarizzato e metabolicamente attivo, pertanto condizioni patologiche come diabete mellito e ipertensione arteriosa, che provocano dei danni ai capillari dei reni, possono influire sulla funzione renale, abbassandone l’efficienza. Tuttavia diabete, ipertensione e insufficienza Renale Cronica sono delle patologie indipendenti con percorsi distinti, sebbene vadano ad influire, tra i molteplici effetti, tutte e tre sulla fisiologia del rene.

Gli spunti derivanti da questa comparazione dell’espressione in individui affetti e non affetti non si limitano solamente a conferire una matrice genetica indipendente alla CKD, ma offrono un ulteriore punto di vista per la comprensione dei meccanismi di sviluppo del diabete. Sono state infatti osservate delle associazioni nominali tra 19 dei 53 geni connessi alla funzione renale e diabete.

Cosa si intende per associazione nominale?

È una tendenza di due elementi a stabilire un’associazione statisticamente rilevante ma non sufficiente a delineare una correlazione definita. In altre parole, questi 19 loci che influenzano la funzione renale, presentano dei polimorfismi probabilmente connessi allo sviluppo del diabete, e per ricostruire un rapporto causa-effetto è necessario determinare in primis una correlazione statistica più chiara, e in seguito procedere con un’analisi dei specifici processi biologici, delle reazioni chimiche e degli intermedi, a cui l’espressione di tali geni è legata.

È probabile che diabete e CKD, pur essendo due patologie indipendenti (alla luce dei risultati di questo studio), presentino tratti comuni nella patogenesi.

L’unico gene associato all’eGFR della creatina che presenta un’associazione genome-wide, statisticamente significativa con lo sviluppo del diabete, è il gene UMOD, identificato precedentemente dal gruppo di studio. Questo gene codifica per l’uromodulina, la proteina più abbondante presente nelle urine in condizioni fisiologiche, espressa al livello dell’ansa di Henle del nefroni del rene. Sebbene la sua funzione non sia stata ancora completamente chiarita, si pensa che sia implicata nella protezione da infezioni delle vie urinarie e dalla formazione dei calcoli renali. In base ai risultati della meta-analisi, il gruppo di studio ritiene che ci sia un’evidenza sul fatto che questo gene, a causa di mutazioni al livello della sequenza, possa essere determinante nella patogenesi del diabete.

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CARATTERIZZAZIONE E ANALISI FUNZIONALE DEI 53 LOCI CONNESSI ALLA FUNZIONE DEL RENE.

Le metodiche utilizzate in questa ricerca sono una sintesi di tre approcci integrati tra loro: analitico, statistico e funzionale. Gli strumenti della statistica sono risultati essenziali per il gruppo di studio, al fine di un’analisi di associazione, e devono essere presi in prestito anche per una caratterizzazione dei geni individuati. Per caratterizzazione s’intende determinare in quali cellule/tessuti/organi sono espressi e in quali precisi schemi metabolici-funzionali sono implicati. I 53 geni individuati vengono analizzati non come singole unità discrete, ma come un complesso genico connesso ad un data funzione, in questo caso, l’attività di filtrazione.

In quei organi sono maggiormente espressi?

Gli scienziati, coordinati dal dott. Pattaro, hanno rilevato, tramite eQTL, 49 regioni cromosomiche connesse allo sviluppo della malattia.  Si sono allora analizzati queste regioni utilizzando come marcatore il gene H3K4me3, un promotore dell’omonima proteina istonica, fondamentale nella regolazione dell’assemblaggio della cromatina. Quest’ultima risulta meno condensata e quindi attiva in fase di trascrizione. In modo particolare tutto ciò accade nel rene, seguito dal fegato e dal tratto rettale. Sono queste le aree in cui questi geni influenzano maggiormente la fisiologia. Al fine di delineare una visione approfondita del funzionamento dei geni identificati, si è proceduto con una comparazione della cromatina tra i vari tessuti. Il risultato è inequivocabile: tali loci trovano espressione ed esplicano la loro informazione soprattutto nel rene.

I geni connessi all’attività filtratoria renale sono espressi all’interno dell’organo stesso. La genetica assume un ruolo di primo piano come fattore determinante in relazione a questa funzione, e quindi all’Insufficienza Renale Cronica.

In quali regioni del genoma sono localizzati?

C’è inoltre un altro dato da considerare: i geni sono stati mappati in prossimità di sequenze regolative, dette enhancer, le quali, legandosi a specifici fattori proteici, regolano la trascrizione e l’espressione genica.

Una vicinanza al livello cromosomico tra geni ed enhancer indica che il sistema biologico si è organizzato in modo da rendere il più efficiente possibile la trascrizione dei geni connessi alla sua fisiologia fondamentale come “filtro” del sangue.

Quali cellule e tessuti del rene sono regolati da questi 53 determinanti gentili?

All’interno del rene, i geni associati al tasso di filtrazione glomerulare, sono espressi nei seguenti comparti cellulari.

  • Cellule epiteliali del cortex.
  • Cellule del tubulo prossimale.
  • Un determinato gruppo di cellule staminali embrionali.
  • Cellule epiteliali amniotiche.

Questo offre un paio di spunti davvero interessanti: analizziamoli insieme.

  • Il fatto che questi geni siano connessi ad elementi legati allo sviluppo embrionale apporta un’ulteriore validazione all’ipotesi che l’eziologia dell’insufficienza renale cronica sia da ricercare, in proporzioni tutt’altro che trascurabili, nei meccanismi ontogenetici che vanno a regolare lo sviluppo del rene.

Questa considerazione si inserisce nell’ipotesi sviluppata nel 1986 dall’epidemiologo David Barker, secondo cui le malattie croniche contratte in età adulta sarebbero conseguenza di interazioni durante lo sviluppo del feto, in cui qualsiasi stimolo o criticità in un momento tanto delicato dello sviluppo avrebbe un effetto permanente sulla struttura, sulla fisiologia o sulla funzionalità dell’individuo. Soffermandoci sugli aspetti causali della malattia, già prima di questa pubblicazione, sebben la CKD compaia in età avanzata, le interazioni tra patrimonio genetico e ambiente durante lo sviluppo fetale erano considerati dei fattori determinanti per la comparsa della CKD in età adulta.

I geni responsabili dell’attività di filtrazione non sono espressi nell’endotelio dei capillari glomerulari così come nel resto della vascolarizzazione: un’ulteriore prova della distinzione eziologica di patologie come diabete e ipertensione rispetto alla CKD.

Quali sono le funzioni cellulari in cui sono implicati?

In questo tipo di studi, a una fase analitica di associazione e a una caratterizzazione “topologica” dei geni individuati, segue un’analisi funzionale, volta a comprendere i meccanismi biologici in cui sono implicati. Ciò non è possibile con le tecniche cosiddette “genetiche”, in quanto evidenziano un’associazione definita solamente con quei geni che mostrano un’influenza significativa e rilevabile nel fenotipo. La comprensione dei pathway metabolici passa per forza di cose per un’indagine molecolare che vada oltre gli schemi statistici e che permetta di identificare anche quei geni che non riflettono un apporto rilevabile alla variabilità del carattere in questione, ma che possono essere fondamentali da un punto di vista biochimico, in quanto codificanti per delle molecole che costituiscono degli intermedi, degli ingranaggi essenziali per la fisiologia del compartimento biologico.

Tuttavia l’equipe del consorzio di ricerca ha posto le basi per nuovi studi di indagine funzionale, procedendo con una generalizzata analisi del pathway, considerando i 53 geni in questione come un unico complesso genetico le cui interazioni (sia tra i geni stessi che tra i loro prodotti) producono nel rene l’attività di filtrazione del sangue.

Tale analisi ci mostra come i geni in questione siano, appunto, connessi a:

  • processi relativi allo sviluppo morfologico del rene e del tratto urogenitale
  • all’attività dei trasportatori transmembrana renali
  • nella regolazione del metabolismo del glucosio

 

Queste associazioni a livello funzionale vanno a validare le considerazioni precedenti sull’origine ontogenetica dell’Insufficienza Renale Cronica. Oltre al numero di nefroni funzionanti, il peso alla nascita cosi come la crescita e la nutrizione nelle prime fasi dello sviluppo sono trattati come fattori ontogenetici che evidenziano un nesso di casualità con l’insorgenza di questo tipo di patologia cronica. Il lavoro del CKDGen, con i suoi illuminanti risultati, percorre questa direzione, dal momento che il gruppo di studio ha osservato che geni connessi all’eGFR sono implicati anche in importanti vie metaboliche di sviluppo dell’organismo, come quelle relativi alla morfologia della placenta e alle dimensioni dell’embrione. Aldilà delle interazioni ambientali, la matrice genetica nella patogenesi della CKD risulta tutt’altro che trascurabile.

Ma non è finita qui. L’aver individuato, in generale, i processi biologici di espressione di questi geni, ci aiuta a comprendere il motivo per cui il diabete mellito sia stato considerato per anni la principale causa della CKD e ci suggerisce che probabilmente queste due patologie hanno in comune dei processi all’interno della patogenesi.

UN NUOVO PUNTO DI PARTENZA PER LO SVILUPPO DI UN PIANO ORGANICO DI INDAGINI FUNZIONALI.

Il complesso quanto brillante studio coordinato dall’EURAC di Bolzano offre alla comunità scientifica un nuovo punto di vista su cui impostare futuri studi per comprendere i meccanismi implicati nello sviluppo e nella fisiologia del rene. Le terapie deputate alla cura della CKD sottendono tutte la necessità di fare maggiore chiarezza in questo campo, ponendo la lente d’ingrandimento sull’espressione dei geni connessi a determinate serie di reazioni chiave. Su tutte la farmacogenetica e la farmacogenomica, branche della farmacologia che valutano i diversi effetti di farmaci sulla variabilità genotipica e fenotipica di individui diversi e ne raccolgono dati per sviluppare delle cure genetico-specifiche, possono offrire delle evoluzioni interessanti in questo senso.

Ci sono, dunque, 53 geni candidati ad influenzare la funzione del rene. Gradualmente, grazie agli sforzi del consorzio CKDGen , il gap di associazione si sta livellando.

Sappiamo che c’è un legame dal genoma fino alla persona  ma cosa c’è in mezzo? Quali sono i meccanismi molecolari esatti? Questo sarà il compito della ricerca degli anni futuri, finalizzata a proporre nuovi target terapeutici dove agire per rallentare il deterioramento costante del rene che avanza con l’invecchiamento.” (Dott. Pattaro)

Bisogna passare da un approccio di studio a forte carattere statistico-quantitativo ad uno molecolare-qualitativo. Si devono andare ad indagare singolarmente, uno ad uno, questi geni in termini di espressione e di effetti nella fisiologia del rene. La sfida, dunque, è accettata dalla comunità scientifica mondiale, in primis dal centro di biomedicina italiano coordinatore dello studio.

E questo rivela la qualità della poco finanziata ricerca scientifica del nostro Paese.


About the Author : Alessandro Martufi

Studente di biologia. Aspirante genetista. Calcio & Rock'n'roll. Razionalmente romantico.

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